靈芝（Ganoderma lucidum）是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，是在全球范圍內用于促進健康的滋補品，可用于處理疲勞，免疫失調以及癌癥。已有的研究揭示了靈芝和多糖提取物的免疫增強作用，其活性可能與腸道微生物菌群有關。靈芝孢子油（GLSO）也是廣受大眾熟知的靈芝產(chǎn)品之一，但目前關于GLSO的免疫促進活性及其潛在機制的研究還十分有限。

近日，在研究GLSO免疫增強特性的過程中，澳門大學中醫(yī)藥研究所中藥質量研究國家重點實驗室的科研人員利用微生物組和代謝組學，分析測定了靈芝孢子油的免疫增特性并有了新發(fā)現(xiàn)?。

研究結果表明：GLSO增強了小鼠的巨噬細胞吞噬作用和NK細胞的細胞毒性。進一步的微生物組和代謝組學研究表明，GLSO引起腸道微生物群的結構重排，介導了多種代謝產(chǎn)物的改變。此外，GLSO引起了一系列關鍵代謝產(chǎn)物的調節(jié)，例如多巴胺，脯氨酰-谷氨酰胺，五甲基甲硫氨酸，亮氨酰-谷氨酰胺，L-蘇氨酸，硬脂酰肉堿，二硫代β-D-葡萄糖基磷酸酯等。這些結果為人們了解GLSO對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用提供了新的見解。實驗結果揭示如下：

1、靈芝孢子油增強免疫力

研究人員通過紫外分光光度計測量得到GLSO中的總三萜含量為每克249mg，并且通過高效液相色譜法（HPLC）測得麥角固醇含量為0.7mg / g。隨后，研究者研究了GLSO在小鼠中的免疫增強作用。在小鼠中使用的GLSO劑量（400-800 mg / kg）與建議的人類使用劑量相同。

圖1.GLSO可增強小鼠的免疫力

連續(xù)27天（每天一次，口服）給藥GLSO后，L和H組對體重得改變均無顯著性差異。與對照組相比，給藥組小鼠得脾和胸腺的形態(tài)保持正常（圖1C），脾臟和胸腺的器官指數(shù)以及血液中白細胞的總數(shù)沒有顯著變化（圖1D–F）。此外，與對照組相比，給藥組的血清溶血素水平（HC50）沒有顯著變化（圖1G）。然而，吞噬指數(shù)α（圖1H）和脾淋巴細胞的細胞毒性活性（圖1I）均有所增加。?

在脾細胞的細胞毒性測定中，將NK細胞敏感的YAC-1細胞用作靶細胞。結果表明GLSO增強了巨噬細胞的吞噬作用并促進了脾NK細胞的細胞毒性，顯示了對細胞免疫的免疫增強作用。因此，以上研究的結果證實，GLSO具有顯著的免疫增強效果，提高了小鼠的免疫能力，特別是在巨噬細胞吞噬作用和NK細胞毒性增加的情況下。

2、靈芝孢子油改變腸道菌群組成

給藥21天后，研究者收集了小鼠的糞便樣品，并對腸道微生物組進行了16S rRNA測序，以觀察GLSO對腸道微生物組的影響。

圖2.腸道微生物群落多樣性與結構分析

結果表明，腸道微生物組的α多樣性可能會降低（圖2A–D），因為與對照組相比，GLSO_H組的 微生物多樣性指標顯著降低（圖2B）。

此外，PCoA分析表明GLSO處理后腸道菌群的結構重排。圖2F顯示了在門分類水平的微生物群落的變化。有趣的是，與對照組小鼠相比，GLSO處理后的厚壁菌門相對豐度降低了，擬桿菌門/壁厚菌門的比率卻顯著提高。因此研究者認為，GLSO處理可響應導致營養(yǎng)不良的環(huán)境因素，并提高腸道微生物群落的適應性。

3靈芝孢子油特異性微生物的鑒定

如圖3A所示，熱圖顯示了30個主要屬的平均豐度，表明腸道菌群組成發(fā)生了顯著變化。乳酸桿菌，雙歧桿菌，擬桿菌，Turicibacter和Romboutsia的相對水平顯著增加。幽門螺桿菌和幽門螺桿菌的數(shù)量減少了（圖3A），乳酸桿菌細菌均明顯富集（圖3B）。

圖3 群體間的一般差異

此外，GLSO可以減少包括葡萄球菌，幽門螺桿菌和Lachnospiracea在內的屬的豐度。?糞便微生物組中不同細菌之間的細菌豐富度差異很大，其中乳酸桿菌，腸桿菌，擬桿菌，酸性桿菌，輪狀桿菌和Turicibacter明顯富集。這些潛在健康的微生物可能是GLSO治療提高免疫力的的重要特征。

圖4 (A)20個最豐富的蝕變物種的三元圖(點的大小表示相對豐度)

(B)線性判別分析(LDA)結合效果(LEfSe)。

4、對比糞便代謝組學中的腸道代謝

腸道微生物組與復雜的宿主微生物代謝軸相互作用。研究人員為了評估響應GLSO誘導的腸道菌群變化的代謝變化，以揭示GLSO處理的小鼠的代謝模式。由于僅高劑量的GLSO（800 mg / kg）顯示出顯著的免疫增強作用，因此研究者僅在高劑量的GLSO處理的小鼠中進行了代謝組學研究。

圖5 糞便代謝組學測定對照組和給藥組的代謝物(n = 10)

(A) 火山圖顯示GLSO組代謝物的積累和變化較對照組具有顯著性差異。

(B) 基于代謝產(chǎn)物改變的PLS-DA圖。(C) 基于代謝物變化的通路富集

研究結果顯示，從陰性和陽性模式中總共鑒定出948種代謝產(chǎn)物。火山圖結果表明，在對照組和給藥組中，從陰性和陽性模式鑒定出的糞便代謝產(chǎn)物的分布存在顯著差異。GLSO處理后，蘇氨酸代謝顯著富集（圖5C），其中直接涉及10種代謝物。主要富集的途徑與氨基酸代謝有關。

5、靈芝孢子油代謝產(chǎn)物的鑒定

為了進一步鑒定與GLSO介導的代謝組學改變相關的關鍵代謝物，研究者進行了生物標記分析。

圖6 鑒定標記代謝物的生物標記物分析和熱圖

(A)使用15個變量的生物標志物模型預測所有樣本的類概率。

（B）所選模型中最重要的25個特征的圖表，依次為從最重要到最不重要。

（C）基于來自生物標志物分析和途徑分析的選定標志物代謝物的所有樣品的熱圖。

所有樣品的預測分類概率表明對照組和用藥組之間的分類較好（圖6A）。圖6B顯示了25種最重要的生物標記物，包括多巴胺，3-甲基腺嘌呤，戊酸蛋氨酸，硬脂酰肉堿，亮氨酰谷氨酰胺，瓜氨酸，二硫代β-D葡糖基磷酸，鳥氨酸，L-蘇氨酸，亮氨酰天冬酰胺等。根據(jù)鑒定出的生物標志物以及參與富集途徑的代謝物，熱圖分析表明對照組和GLSO處理組的代謝模式完全不同（圖6C）。GLSO處理后，大多數(shù)代謝物改變，以及與免疫調節(jié)有關的證據(jù)表明，腸道微生物代謝軸對于GLSO在小鼠中的免疫增強作用至關重要。

6、靈芝孢子油免疫增強作用的關鍵特征

基于上述糞便微生物組和代謝組學數(shù)據(jù)，研究者隨后進行了Pearson的相關分析，以鑒定GLSO治療后與免疫促進相關的微生物和代謝產(chǎn)物。?如圖7所示，吞噬指數(shù)和NK活性與乳酸桿菌和輪狀桿菌的豐度增加以及葡萄球菌的減少顯著相關。

圖7 吞噬指數(shù)、NK活性、關鍵代謝物和變異微生物之間的Pearson相關性分析正相關顯示為紅色，負相關顯示為綠色。

顯著性表示為：* p<0.05，**p <0.01，*** p <0.001。

L. intestinalis和 L. reuteri與NK細胞活性呈正相關。乳桿菌屬與多巴胺，脯氨酰谷氨酰胺，五亞甲硫氨酸，亮氨酰谷氨酸，L-蘇氨酸，N6-β-天冬氨酰賴氨酸和L-精氨酸呈正相關，與硬脂酰肉堿，二硫代β-D-葡萄糖基磷酸酯呈負相關，反式-哌啶，肌酸，高香草酸和3-甲氧基-4-羥基苯基乙二醇。葡萄球菌與原卟啉原IX以及肌酸有正相關。吞噬指數(shù)和NK活性也與大多數(shù)標記代謝物高度相關。因此，研究者認為GLSO的免疫增強作用與微生物代謝軸的特異性改變有關。

結論

研究調查了高價值的膳食補充劑靈芝孢子油（GLSO）的免疫增強作用。其中800 mg / kg用藥組顯著增強了ICR小鼠的先天免疫和細胞免疫。進一步的微生物組和代謝組學研究表明，GLSO誘導了腸道菌群的結構重排，介導了多種代謝物的改變。研究發(fā)表在藥理學界主流雜志《藥理學研究》(Pharmacological research)上，為人們了解GLSO對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用提供了新見解。

文章來源：
Xu Wu, Jiliang Cao, Mingxing Li, et al. An integrated microbiome and metabolomic analysis identifies immunoenhancing features of Ganoderma lucidum spores oil in mice. 2020, 158

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